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當(dāng)前位置:首頁(yè)技術(shù)文章馬鼻疽桿菌檢測(cè)試劑盒(實(shí)時(shí)熒光PCR法)說(shuō)明書

馬鼻疽桿菌檢測(cè)試劑盒(實(shí)時(shí)熒光PCR法)說(shuō)明書

更新時(shí)間:2025-04-29點(diǎn)擊次數(shù):325

馬鼻疽桿菌檢測(cè)試劑盒(實(shí)時(shí)熒光PCR法)說(shuō)明書

【產(chǎn)品名稱】

通用名稱:馬鼻疽桿菌檢測(cè)試劑盒(實(shí)時(shí)熒光PCR法)

英文名稱:Malleomyces mallei Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】 25T/& 50T/

【預(yù)期用途】

本試劑盒利用實(shí)時(shí)熒光PCR原理,定性檢測(cè)馬鼻疽桿菌,對(duì)馬鼻疽桿菌的診斷和監(jiān)控具有重要指導(dǎo)意義。

【檢驗(yàn)原理】

本試劑盒針對(duì)馬鼻疽桿菌基因設(shè)計(jì)特異性引物和分子信標(biāo)探針,在待檢樣本中含有馬鼻疽桿菌DNA的情況下,PCR反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放熒光信號(hào)。利用儀器對(duì)PCR過(guò)程中相應(yīng)熒光信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和輸出,實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的定性分析。

【主要組成成份】

序號(hào)

組成

25 T/

50 T/

1

  馬鼻疽 PCR反應(yīng)液

500 μL×1

1000 μL×1

2

馬鼻疽 陽(yáng)性對(duì)照

40 μL×1

40 μL×1

3

馬鼻疽 陰性對(duì)照

40 μL×1

40 μL×1

4

說(shuō)明書

1

1

 

 

 

 

 

 

注:陰性對(duì)照為滅菌純水,陽(yáng)性對(duì)照為馬鼻疽桿菌靶基因的質(zhì)粒

【儲(chǔ)存條件及有效期】避光-20℃以下保存,避免反復(fù)凍融,有效期12個(gè)月。

【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列、Roche LightCycler 480Cepheid SmartCyclerRotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

【樣本要求】

1.血液或血清樣品:使用無(wú)菌注射液抽取樣品置于離心管中待檢。

2.標(biāo)本采集管應(yīng)包含含有蛋白穩(wěn)定劑的病毒運(yùn)輸液。

3.應(yīng)避免標(biāo)本間交叉污染。

4.標(biāo)本收集后可立即檢測(cè);若不能立即檢測(cè),可置于28℃冷藏過(guò)夜保存;如需長(zhǎng)期保存,標(biāo)本應(yīng)凍存于-80以下,避免反復(fù)凍融。

【檢驗(yàn)方法】

1. 試劑準(zhǔn)備(試劑準(zhǔn)備區(qū))

1)從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實(shí)驗(yàn)所需試劑,充分融化混勻并瞬時(shí)離心以去除管壁附著液體。

2)核算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的反應(yīng)數(shù)(n),并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的各種試劑量。

n =陰性對(duì)照數(shù)(1T+陽(yáng)性對(duì)照數(shù)(1T+誤差預(yù)留量(1T+樣本數(shù)

單反液配制表()

PCR反應(yīng)液UNG酶及Taq酶)

20 μL

3)在無(wú)菌離心管中加入上述試劑,充分混勻后瞬時(shí)離心。按照20μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管。

4)蓋緊PCR反應(yīng)管蓋后將PCR反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。剩余試劑放回-20℃以下冰箱冷凍保存。

2.樣本準(zhǔn)備(樣本處理區(qū))

DNA/RNA提取試劑盒提取核酸即可,具體操作按照其試劑盒說(shuō)明書操

3.加樣

在上述制備好的PCR反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測(cè)標(biāo)本DNA5 μl、終體積25 μl/管,蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心,轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對(duì)照或陽(yáng)性對(duì)照品,終體積為25 μl/管,蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心,轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。

4.PCRPCR擴(kuò)增區(qū))

1)取樣本處理區(qū)準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管,放置在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置,并記錄放置順序。

2)按下表設(shè)置儀器核酸擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。


反應(yīng)體積

25 μL

通道選擇

FAM通道采集馬鼻疽熒光信號(hào)

PCR

反應(yīng)

條件

步驟

條件

循環(huán)數(shù)

UNG處理

372分鐘(min

1

預(yù)變性

95℃3分鐘(min

1

PCR擴(kuò)增

95℃5秒(s

40

55℃40秒(s

(此階段結(jié)束時(shí)采集熒光信號(hào))

注:ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時(shí)不選ROX校正,設(shè)置淬滅基團(tuán)選擇None

【參考值(參考范圍)】

1.試劑盒有效性判定:

1)陽(yáng)性對(duì)照:有典型S型擴(kuò)增曲線或Ct≤35

2)陰性對(duì)照:Ct值>38或無(wú)Ct值,線形為直線或輕微斜線,無(wú)指數(shù)增長(zhǎng)期。

2.標(biāo)本結(jié)果判定:

1陽(yáng)性:標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct≤35或有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期。

2)可疑:標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值在3538范圍內(nèi)。此時(shí)應(yīng)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測(cè),如重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct值仍在3538范圍內(nèi),有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期,則判定為陽(yáng)性,否則為陰性。

3)陰性:標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值>38或無(wú)Ct值。

【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

通道及檢測(cè)結(jié)果

標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果解釋

FAM

陽(yáng)性(+)

標(biāo)本中檢測(cè)馬鼻疽桿菌

陰性(-)

標(biāo)本中檢出馬鼻疽桿菌

【檢驗(yàn)方法的局限性】

1. 當(dāng)檢測(cè)樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的di檢出shi可能會(huì)發(fā)生假陰性的結(jié)果。

2. 被檢樣本在采集、運(yùn)輸、儲(chǔ)存以及處理過(guò)程中操作方式不當(dāng)容易造成DNA降解而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。

3. 樣本在采集、運(yùn)輸、儲(chǔ)存以及處理過(guò)程中發(fā)生交叉污染,則容易得到假陽(yáng)性結(jié)果。

【產(chǎn)品性能指標(biāo)】 產(chǎn)品的di檢出限為103 Copies/mL,產(chǎn)品CV3%

【注意事項(xiàng)】

1. 使用本試劑盒的實(shí)驗(yàn)室,應(yīng)嚴(yán)格按照國(guó)家有關(guān)部分頒布的有關(guān)基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范進(jìn)行管理

2. 為避免RNA降解,樣本處理過(guò)程應(yīng)在0-4℃條件下操作,且完成實(shí)驗(yàn)后立即上機(jī)檢測(cè);樣本處理過(guò)程中使用的器具耗材應(yīng)經(jīng)過(guò)無(wú)核酶處理

3. 各區(qū)域物品均為專用,不得交叉使用,以免污染檢測(cè)結(jié)束后,應(yīng)立即對(duì)工作臺(tái)清潔

4. 吸取反應(yīng)液時(shí),應(yīng)盡量避免產(chǎn)生氣泡 PCR 儀前,應(yīng)注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊,以免液體蒸發(fā)造成結(jié)果不準(zhǔn)確

5. 試劑盒所有試劑在使用前應(yīng)該在常溫下充分融化混勻,并應(yīng)瞬時(shí)離心;

6. 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽(yáng)性對(duì)照在第一次使用前應(yīng)全部轉(zhuǎn)移至標(biāo)本準(zhǔn)備區(qū),并單獨(dú)存放

7. 為防止熒光干擾,應(yīng)避免裸手直接接觸PCR反應(yīng)管,并應(yīng)避免在PCR反應(yīng)管上進(jìn)行任何標(biāo)記

8. 檢測(cè)過(guò)程中使用過(guò)的吸頭,應(yīng)直接打到盛有 10%次氯酸的廢物缸內(nèi),檢測(cè)結(jié)束的PCR 反應(yīng)管,切忌開蓋,并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄工作臺(tái)及各種實(shí)驗(yàn)用品應(yīng)定期用 10%次氯酸、75%酒精或紫外燈進(jìn)行消毒

9. 儀器擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)應(yīng)按照本說(shuō)明書相關(guān)要求進(jìn)行設(shè)置;不同批號(hào)試劑不能混用并在有效期內(nèi)使用


 


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